(1 Day)

 Preparation

 1. 70℃ 에서 10 min 동안 slide  warming (hot plate 이용)

 2. Xylene 5 min x 2

 3. 100% 에서 3min x 3

 4. DW  2min x 3

 Pretreatment

 1. 95℃ 에서 prewarming 한 Heat Pretreatment Solution에 15min 동안 

　  incubation 한후, 즉시 DW 에 2min 씩 3번   washing한 후, air dry한다.

 2. Pepsin은 사용하기 전에 실온에 미리 준비해 놓는다.

 3. Pepsin solution을 떨어뜨리고, 실온에서 incubation 10 min.(습윤상태)

    **tissue 는 10-30min, cell 은 5-10min 동안 처리

 4. DW 3 X 2 min. 동안  washing한다.

 5. 탈수 : 70%, 90% 100% Ethanol 에 각 2min , air dry 시킨다.

 Denaturation&Hybridization

 1.  CISH probe를 vortex 한 후, sample 당 15ul 씩 분주한다.

 2. 기포가 생기지 않도록 주의해서 cover slip(22mmx22mm) 덮은후, 

    주위를 sealing 한다. (rubber cement)

 3. 94℃ (±2℃) 에서 5 min 동안 denaturation

 4. 37℃  에서 overnight 으로 hybridise (습윤상태유지)

 (2 Day)

 Denaturation&Hybridization

 1. rubber cement 를 조심스럽게 제거한다.

 2. wash buffer SSC가 들은 jar에서 5분동안 coverslip 제거

 3. prewarming한 75-80℃ wash buffer SSC 5 min.동안 washing한 후,

    DW에서 3 X 2 min. washing한다.

    (주의 : 슬라이드 2장이상 시, 슬라이드 1장당 1 ℃씩 온도를 높인다.

    단,80℃이상 올라가지 않도록…)

 4. 3% H2O2 10 min. incubation한다.

 5. PBS(+Tween) buffer 3 x 2 min. washing한다.

 6. 슬라이드에 Blocking Solution 을 떨어뜨리고 10 min. incubation한다.

 7. blocking solution을 제거하고, (중요! rinse하지 말것!!!)

 8. 슬라이드에 mouse-Anti-DIG 를 떨어뜨리고 30 min. incubation한다.

 9.PBS(+Tween) buffer 3 x 2 min. washing한다.

 10.슬라이드에 Anti-Mouse-HRP Polymer 를 떨어뜨리고 30 min. incubation한다.

 11.PBS(+Tween) buffer 3 x 2 min. washing한다.

 12. washing단계동안, DAB Solution준비(DAB solution B 1ml +DAB solution A 한방울)

 13.슬라이드에 DAB Solution을 떨어뜨리고 30 min. incubation한다.

 14.슬라이드를 staining jar로 옮겨 흐르는 수돗물에 2 min. washing한다.

 15. Mayer's hematoxlin solution으로 8-10 초동안 counter staining한다.

 16.슬라이드를 staining jar로 옮겨 흐르는 수돗물에 2 min. washing한다.

 17.탈수 : 70%, 90% 100% Ethanol 에 각 2min 씩

 18. xylene에서 2 x 2 min. incubation한 후, 약 15분정도 air dry한다.

 19. mouting solution으로 봉입한다.