Preperation

1. coating slide (x-tra slide #00212, surgipath)  부착된 조직을  56℃~60℃ 에서 warming

2. Xylene 5min x 2

3. 100% alcohol 5min x2

4. 95% , 90%, 80% alcohol 에 각각 5min

5. DW 또는 Tap water

(Option)  Pretreatment I

HIER method

  citrate buffer (pH6.0), EDTA (pH8.0), Tris-EDTA(pH9.0) 등 Ab 에 따라서 선택적으로 사용하며, 

아래 3가지 방법 중 택일하여 처리하면 된다

1. Autoclave 사용 

    121℃ 10min 분간 처리

2. Electronic presscooker 사용 ( cell marque사)

    121℃ 15min 분간 처리

3. Microwave 사용

    warming 후에 끓기 시작할때부터 15분 정도 처리한다. 보통 buffer 가 줄기 때문에 중간에 보충해주고 다시 warming 한 후에 끓기 시작할때부터 시간을 추가한다.

boiling 한 후에, buffer에 담근 상태로 20분 동안 cooling 한후, TBS or PBS 에 washing 한다. 

pap pen 으로 조직주변을 그려준 후, IHC detection step..

 (Option)

Pretreatment II

 Enzyme method

  Pepsin , Trypsin, Fisin, Protease K 등 효소에 따라 incubation 시간이 틀리다

일반적으로 pepsin 을 가장 많이 사용한다

1.  pap pen (#K039, DBS사) 으로 조직주변을 그려준다

2. Pepsin (#E06-50, GBI사) 실온에서 10분처리 

3. TBS or PBS buffer 에  washing

     IHC detection step 으로..

 IHC

Detection KIT

Ultra One/HRP

    #TL-125-HLJ

Polink-1 HRP

    #D11-110

1. 3% Hydrogen peroxidase (#TA-125-HP, LAB VISION) 10분 (R.T) 

2. TBS or PBS washing 3min x 2

3. Blocking solution  5분 (option) 

   *washiong 하지 않고 깨끗하게 제거만 한다 

4. Primary Ab 30분 (R.T) or 4℃에서 over night  

   * 적정한 농도로 antibody dioluent 를 이용해서 희석해서 사용한다

5. TBS or PBS washing 3min x 2

6. Polymer HRP 30분 ( R.T) 

   * Polink-1 HRP (gbi사) 는 실온에서 10분

7. DW washing 5min x2

8. chromogen ( DAB 는 3~5분, AEC 는 5~10분 현미경 보면서 )

9. DW washing

10 . Mayer's Hematoxylin (#HMM500, scytek)  1분~ 3분

11. DW - buffer - DW 로 washing

12. (option) bluing buffer (#BRT500, scytek) 1~3 분

13. DAB 로 발색한경우, 저농도->고농도 alcohol 단계를 거쳐 xylene 한후에 permernant mount 

                                                                    (#01120, sugipath사)