(1 Day)

 Preparation

 1. 70℃ 에서 10 min 동안 slide  warming (hot plate 이용)

 2. Xylene 10 min x 2

 3. 100% , 90%, 70% Ethanol  에서 각 각 5min

 4. DW  2min x 2

 Pretreatment

 1. 98℃ 에서 prewarming 한 FISH Pretreatment Sol. Citric I 에 15min 동안 

　    incubation 한후, 즉시 DW 에 2min 씩 2번   washing 후 air dry 시킨다.

 2. Pepsin은 사용하기 전에 실온에 미리 준비해 놓는다.

 3. Pepsin solution (1)을 떨어뜨리고, 37℃ 에서 incubation (습윤상태)

    **tissue 는 10-30min, cell 은 5-10min 동안 처리

 4. 2x SSC 에서 5min 동안  washing 한후, DW 에 1min 동안 washing

 5. 탈수 : 70%, 90% 100% Ethanol 에 각 각 1min , air dry 시킨다.

 Denaturation&Hybridization

 1. FISH probe(2) 를 vortex 한 후, sample 당 10ul 씩 분주한다.

 2. 기포가 생기지 않도록 주의해서 cover slip(22mmx22mm) 덮은후, 

     (암실에 준비)    주위를 sealing 한다. (rubber cement)

 3. 75℃ (±2℃) 에서 10min 동안 denaturation

 4. 37℃  에서 overnight 으로 hybridise (습윤상태유지)

(2 Day)  

 Preparation

 1. 1x wash buffer  : 25 x wash buffer(3)을 1:25로 희석해서 5개의 staining jar에 

(암실에 준비)    채우고 37℃ 로 prewarming 시켜 놓는다.

　 2. 70%, 90%, 100% Ethanol준비

　 3. DAPI (4) 는 사용하기 전에 실온에 꺼내 놓고, 빛에 노출되지 않도록 한다.

 Denaturation&Hybridization

 1. rubber cement 를 조심스럽게 제거한다.

 2. 37℃ 에 prewarming 한 1x wash buffer 안에 1-3분간 담근상태로 cover slip 을

    (암실에서 실험)   제거한다.

 3. 37℃ 에 prewarming 한 1x wash buffer  에 5min x 4

 4. 70%, 90%, 100% Etahnol 에 각 각 1min 씩 washing 후 빛으로부터 차단시키고

    sample 을 air dry 시킨다.(또는 DW 에 5min washing 후, air dry 시킨다)

 5. DAPI/antifade- solution(4)을 slide 상에 30ul 떨어뜨리고, 기포가 생기지 

    않도록 주의해서 cove slip(24mmx60mm) 을 덮는다. 암실에서 15분간  incubation

 6. Filter paper 사이에 slide 를 놓고 가볍게 눌러 여분의 DAPI/antifade sol 을 제거

 7. 형광현미경으로 검경하기 이전까지는 암실에서 보관, 장기간 보관시 4℃ 보관