Protocol
Preperation
1. coating slide (x-tra slide #00212, surgipath) 부착된 조직을 56℃~60℃ 에서 warming
2. Xylene 5min x 2
3. 100% alcohol 5min x2
4. 95% , 90%, 80% alcohol 에 각각 5min
5. DW 또는 Tap water
(Option) Pretreatment
HIER method
citrate buffer (pH6.0), EDTA (pH8.0), Tris-EDTA(pH9.0) 등 Ab 에 따라서 선택적으로 사용하며,
아래 3가지 방법 중 택일하여 처리하면 된다
1. Autoclave 사용 121℃ 10min 분간 처리
2. Electronic presscooker 사용 ( cell marque사)
121℃ 15min 분간 처리
3. Microwave 사용
warming 후에 끓기 시작할때부터 15분 정도 처리한다. 보통 buffer 가 줄기 때문에 중간에
보충해주고 다시 warming 한 후에 끓기 시작할때부터 시간을 추가한다.
boiling 한 후에, buffer에 담근 상태로 20분 동안 cooling 한후, TBS or PBS 에 washing 한다.
pap pen 으로 조직주변을 그려준 후, IHC detection step..
Enzyme method
Pepsin , Trypsin, Fisin, Protease K 등 효소에 따라 incubation 시간이 틀리다
일반적으로 pepsin 을 가장 많이 사용한다
1. pap pen (#K039, DBS사) 으로 조직주변을 그려준다
2. Pepsin (#E06-50, GBI사) 실온에서 10분처리
3. TBS or PBS buffer 에 washing IHC detection step 으로..
IHC Detection KIT
Spilink kit
#D01-110
1. 3% Hydrogen peroxidase (#TA-125-HP, LAB VISION) 10분 (R.T)
2. TBS or PBS washing 3min x 2
3. Blocking solution ( 10% normal serum ) 10분
#D01-110 *washiong 하지 않고 깨끗하게 제거만 한다
4. Primary Ab 30분 ~ 1시간 (R.T) or 4℃에서 over night
* 적정한 농도로 antibody dioluent 를 이용해서 희석해서 사용한다
5. TBS or PBS washing 3min x 2
6. Biotin labeled 2nd Ab 10분 ( R.T)
7. TBS or PBS washing 3min x 2
8. streptavidin-HRP 10분 (R.T)
9. DW washing 5min x2
10. chromogen ( DAB 는 3~5분, AEC 는 5~10분 현미경 보면서 )
11. DW washing
12 . Mayer's Hematoxylin (#HMM500, scytek) 1분~ 3분
13. DW - buffer - DW 로 washing
14. (option) bluing buffer (#BRT500, scytek) 1~3 분
15. DAB 로 발색한경우, 저농도->고농도 alcohol 단계를 거쳐 xylene 한후에
permernant mount
(#01120, sugipath사) AEC 로 발색한 경우, washing 한 후에 수용성 mount 로 봉입 (AMT060, scytek or E03-100, GBI)