Protocol
Hybridization ZytoFast EBV - ISH Protocol (Zytovision)
Preparation
√ Washing buffer 준비 (X20) 5개 준비 ( 1개는 55℃ prewarming, 나머지는 실온)
√ probe solution 은 사용전에 55℃ prewarming ( 사용전 shake or vortex )
√ detection 과 wash regent 는 사용전 RT 에서 warming ( 사용전 shake or vortex )
√ slide 는 Dewax ( 70℃ 10분동안 slide warming -> 100% xylen 10분 x2 ->100 ethanol5분x1)
√ Slide 를 air dry 시킨다.
Pretreatment
1. Pepsin solution 4-5 방울을 slide 조직위에 떨어뜨린후 37℃ 에서 30분 incubation 한다
2. Stopping pepsin treatment : 100% enthanol 에 10 초동안 슬라이드를 담군다.
3. DW 로 30초 Washing 한다.
4. Slide 를 air dry 시킨다.
Hybridization
1.EBV probe 20ul 를 조직위에 떨어뜨려 coverslip (18x18) 으로 덮고 sealing한 후, 55℃ 에서 2 시간 incubation 한다.
2. coverslip 을 제거한후, RT 에서 wash buffer 에 5분동안 담군다.
3. 55℃ 에 warming한 washing buffer 에 5분동안 washing 하고, RT 에서 5분동안 washing 한 다.
4. DW 로 2-3 초간 Washing 한다.
5. Slide 를 air dry 시킨다.
Detection
1. AP-anti-Biotin 4-5 방울을 조직위에 떨어뜨린후, 34℃ -37℃ humidity chamber 에서
30분 incubation 한다
2. wash buffer 로 2분동안 washing 을 2번 한다.
3. DW 로 2분 Washing 한다.
5. AP substrate 4-5 방울을 조직위에 떨어뜨린후 34℃ -37℃ humidity chamber 에서
40~60분 incubation 한다
6. DW 로 2분동안 washing 을 3번 반복한다.
1. coplin jar 5개 ~8개
2. Mounting ( 수용성 봉입제 사용 )
3. fixogum
option : counter staining ( green or red)
장비 : water bath (55도), Hybridizer